服務(wù)熱線
021-54479081
021-54461587
-
實(shí)用ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)對(duì)照信然有方法
發(fā)布時(shí)間： 2015-03-09 點(diǎn)擊次數(shù)： 1922次由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)，ELISPOT比ELISA更靈敏，能從20萬-30萬細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。
捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的單抗，ELISA試劑盒在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。
目前ELISA法仍在研究當(dāng)中占有著主流地位，ELISA試劑盒的普遍應(yīng)用使得實(shí)驗(yàn)更加方便、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確，ELISPOT技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)也決定了它的發(fā)展?jié)摿ΑISPOT法來源于ELISA，相比較傳統(tǒng)的ELISA法有所突破，是定量ELISA技術(shù)的延伸和發(fā)展。由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和CK分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)。
隨著ELISPOT技術(shù)的不斷發(fā)展，它的優(yōu)勢(shì)也漸漸顯示出來，下面將ELISPOT與ELISA法對(duì)比區(qū)分。
ELISA試劑盒通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。
ELISPOT 也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過計(jì)算機(jī)輔助的分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)， 1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。(某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率)
ELISPOT的起源可以追溯到1963年JerneELISA試劑盒等人創(chuàng)立的溶血空斑技術(shù)(hemo-lytic plaque forming cell assay ，HPF)，這項(xiàng)技術(shù)可用于檢測(cè)并計(jì)數(shù)單個(gè)抗體形成細(xì)胞。隨著單克隆抗體技術(shù)的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法檢測(cè)脾細(xì)胞中分泌特異性抗體的細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)該方法敏感性高簡便易行。后來，他們又用這種方法定量分析受到有絲分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的細(xì)胞數(shù)。隨后，用ELISPOT法在單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌其他細(xì)胞因子(如IL-2 ， IL-4 ， IL-5 ， IL-10 ， TNFα和IL-6) 數(shù)量的手段也被建立起來。ELISA試劑盒Nordstrom 等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法來提高這種方法的敏感性，Herr用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(computer-assisted video image analysis ，CVIA) 自動(dòng)分析TNF2α酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的大小和數(shù)量，計(jì)算與負(fù)載抗原肽的靶細(xì)胞接觸后外周血單核細(xì)胞(PBMC) 中抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，ELISA試劑盒不但提高了對(duì)背景染色的分辨力也使大規(guī)模研究成為可能。Vaquerano等將數(shù)碼相機(jī)和計(jì)算機(jī)結(jié)合起來，開發(fā)出類似的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)系統(tǒng)，認(rèn)為當(dāng)每孔斑點(diǎn)數(shù)大于100時(shí)，這種方法更客觀、可重復(fù)性高且節(jié)省時(shí)間。